黄曲霉毒素M1免疫亲和柱操作说明书

【概要】

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，被世界卫生组织的癌症研究机构划分为1类致癌物，同时又是一种毒性极强的剧毒物质，广泛存在于各种食物中。玉米，花生，大米，小麦等谷物及其副产品是黄曲霉毒素的主要来源，同时饲料中的黄曲霉毒素B1经过动物代谢后产生的黄曲霉毒素M1仍然具有很强的毒性和致癌性，也广泛存在牛奶，血液，组织等食品中。黄曲霉毒素作为肝癌的三大诱因之一，也是胃癌，肠癌等疾病的主要原因，对人类的健康构成很大威胁。世界各国对食品，饲料中的黄曲霉毒素都有严格的限量标准。2010年6月1日开始施行的乳品安全国家标准中对乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的检测进行了规定，主要使用的样品前处理方法就是免疫亲和柱净化法。

【适用范围及性能】

用于定性、定量检测牛奶，奶粉，发酵乳，干酪，奶油等样品中黄曲霉毒素M1的样品前处理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥90%

【试验原理】

本产品的测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素M1单克隆抗体连接在柱内凝胶上，样品中的黄曲霉毒素M1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢的通过黄曲霉毒素M1免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内，毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素M1，然后注入到分析仪器中用于检测。

【包装组成】

根据不同规格，每一个盒中包含5-25支黄曲霉毒素免疫亲和层析柱及1份说明书。

【需要而未提供的设备及试剂】

设备：

┅┅高速均质器或组织匀浆机

┅┅粉碎机

┅┅200mL/50mL量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅酸度计

┅┅分液漏斗

┅┅微量移液器：单道 100L～1000L

┅┅槽纹滤纸（折叠快速定性或定量滤纸）

┅┅50mL漏斗

┅┅旋转蒸发仪

┅┅一次性玻璃试管

┅┅泵流操作架（包括空气泵，不同容积的玻璃注射器等）

┅┅烧杯，容量瓶，锥形瓶等

试剂：

┅┅甲醇（色谱级）

┅┅乙腈（色谱级）

┅┅石油醚

┅┅蒸馏水或去离子水

┅┅氢氧化钠溶液（0.5mol/L）称取2g氢氧化钠溶解于100mL水中

【样本处理步骤】

（一）牛奶

┅┅将100mL牛奶水浴加热至40 oC；

┅┅4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

（二）乳粉和粉状婴幼儿配方食品

┅┅称取10g奶粉样品，将100mL50 oC水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

（三）发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)

┅┅称取60 g混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；

┅┅用高速均质器在 9500 转/分钟下告诉匀浆5 min

┅┅水浴加热至40 oC；

┅┅4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

（四）干酪

┅┅称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均质器在 9500r/分钟下告诉匀浆5 min；

┅┅超声提取30 min；

┅┅在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3），振摇2 min；

┅┅待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。

┅┅重复用石油醚提取2次；。

┅┅将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；┅┅浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；

┅┅加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。

（五）奶油

┅┅称取5g试样，置于50 mL烧杯中；

┅┅用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；

┅┅待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。

【亲和柱净化步骤】

┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL清澈液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。

┅┅准确加入1mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

【结果判定】

经免疫亲和柱净化后，收集到的乙腈洗脱液可直接使用荧光计或者HPLC检测，也可使用薄层色谱或者酶联免疫试剂盒进行检测。收集到的1ml洗脱液中的黄曲霉毒素含量相当于10ml牛奶样品、发酵乳样品或者1g奶粉样品、干酪样品和奶油样品中黄曲霉毒素M1的含量。

如果HPLC检测需要其它溶剂，可以将乙腈洗脱液氮气吹干，然后复溶

【注意事项】

┅┅黄曲霉毒素危害极大，应戴手套操作。

┅┅使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用5%浓度的次氯酸钠溶液浸泡过夜。

┅┅不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

【贮藏条件及保存期】

贮藏条件：亲和柱可于常温保存，2-8℃储存可延长有效期，不可冻存。

保存期：该产品有效期为12个月。